荧光是自然界中的一种光致发光现象。由于其灵敏度高、即时反馈、操作便捷等特点，使得荧光成像在临床医学诊断、基础生物学探索及解剖学结构研究中有着巨大的优势。而借助于多种荧光探针同时标记多个待测物的多重荧光成像技术，研究人员能够对多个待测物的活动进行实时动态的追踪，有利于揭示生物体复杂的生理-病理机制。目前该成像技术主要集中在可见光区（400-650 nm）及近红外一区（650-900 nm），由于存在生物组织对该窗口光的吸收和散射强等问题，使得在这个窗口内的光学穿透深度和成像分辨率都不理想。为了解决这个问题，研究人员通常会采用手术开辟视窗的方法来暴露所研究的

部位，从而期望能够更精准的理解活体原位微环境的生理机制，但视窗不可避免地对正常生理环境造成破坏，为检测结果带来不可控的干扰。因此如何在深层组织中实现多重荧光成像是阻碍这一技术进一步发展的至关重要的问题。近年来的研究表明，近红外第二窗口的光（1000-1700 nm）在皮肤、脂肪和骨骼等生物组织中传播时受到比可见光和近红外一区光更小的散射作用和生物体自发荧光背景噪声。尤其对于波长位于1500-1700 nm的子成像窗口，其受到的组织散射进一步降低，生物体自发荧光背景噪声几乎消失，因此被认为是一个实现活体深组织高分辨和高信噪比成像极具发展潜力的生物 “透明”

窗口。然而位于该“透明”成像窗口的动态多重活体荧光成像研究仍旧不理想，一方面是受限于该成像窗口可用的荧光探针，目前已报道的只有基于Er3+的稀土荧光探针以及半峰宽度大的半导体量子点；另一方面是缺乏相应能够进行实时多重荧光成像的装置和技术，因此无法在活体实现实时动态的多重荧光成像。针对以上难题，研究团队开发了一系列立方晶相的稀土碱金属氟化物纳米荧光探针，并搭建了双通道荧光成像装置，在1500-1700 nm波段实现了活体实时动态的多重成像。传统的研究中，由于六方晶相的稀土碱金属氟化物（β-NaREF4）具有较小的声子能，从而导致的更低的非辐射弛豫概率，通常

被认为更加有利于提高发光效率，因此作为一种经典的稀土探针基质而广泛使用。而团队成员发现，相较于β-NaREF4基质，在立方晶相的碱金属氟化物（α-NaREF4）基质中，Tm3+掺杂的稀土荧光探针在1632 nm处中有近百倍的下转移发光增强。通过拉曼光谱、变温荧光及光子数测试证明α-NaREF4基质较高的声子能有效地促进了Tm3+的电子从3H4能级通过非辐射跃迁的方式到达3F4能级，从而增强了3F4能级的电子布居，且立方相基质中激活剂离子间的交叉弛豫以及激活剂离子与敏化剂离子之间的能量传递过程也进一步导致了Tm3+在1632 nm处的下转移发光增强。基于此

荧光增强机理，也实现了Er3+和Ho3+掺杂的近红外稀土荧光探针在1530 nm和1180 nm处不同程度的下转移发光增强。该Tm3+元素掺杂的新型近红外稀土荧光探针为近红外二区多重荧光成像提供了新的波长选择。图1：(a-b) Tm3+掺杂的立方相纳米颗粒核壳结构示意图及电镜图；(c-d) Tm3+掺杂的立方相及六方晶相纳米颗粒发射光谱及不同波长处发光强度柱状图；(e) 低温吸收光谱；(f) 基于Tm3+、Er3+、Ho3+掺杂的立方相纳米颗粒发射光谱及脂肪乳剂的吸收、散射曲线；(g) Yb-Tm体系能量传递机理；(h)Er3+和Ho3+元素掺杂的立方相

和六方相纳米颗粒的发射光谱及荧光成像图。针对所开发的系列近红外第二窗口荧光增强的新型稀土荧光探针，张凡团队进一步开发了与之匹配的高时空同步的实时动态多重成像装置。与常规通过切换滤光片实现多通道成像的系统相比，该成像装置能够对两个不同通道的荧光信号进行实时同步收集，体外不同荧光探针同时修饰的不同微球运动模拟实验也验证了装置能够保证双通道高度同步的时空成像，为后续多种新型近红外稀土荧光探针用于活体实时动态多重荧光成像打下基础。最后，团队在生物组织精细结构水平上验证了该成像技术用于探索深组织生理活动机制的可行性。首先通过对不同近红外稀土荧光探针表面进行功能化修